La práctica la pudimos realizar en una cocina
normal, como se puede realizar en un
laboratorio de un centro. La
extracción de
ADN requiere hacer varias series de etapas
básicas. En primer lugar tienen que romperse la pared
celular y la membrana plasmática para
poder acceder al
núcleo de
la célula. Después debe romperse
igual la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por
último hay que proteger el ADN de
enzimas que puedan
disminuirlo y para aislarlo hay que hacer que se precipite en
alcohol. El ADN es soluble en
agua, pero cuando se encuentra en
alcohol se desenrolla y precipita en la interface entre el
alcohol y
el agua. Además de permitirnos ver el ADN, el
alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales
son dejados en la solución acuosa. La sal evita la
unión de las
proteínas al ADN.
Objetivos
-Realizar la extracción de ADN de
tejidos
animales y vegetales y reflexionar sobre la simpleza de su
composición con sencillas
técnicas.
- Observar la
estructura fibrilar del ADN.
Material
necesario
- Muestra vegetal (cebolla, ajó,
tomate,
etc.)
- Agua (destilada o mineral)
- Sal de mesa
- Bicarbonato sódico
- Detergente líquido o champú
- Alcohol isoamílico a 0°C
- Batidora
- Nevera
- Colador o centrífuga
- Vaso
- Tubo de ensayo
- Varilla fina
1.- Preparar el tampón con los siguientes
ingredientes y mantener en la nevera o en un baño de hielo
triturado:
-
120 ml de agua, si es posible destilada y si no
mineral. No usar agua del grifo.
-
1,5 g de sal de mesa, preferiblemente
pura.
-
5 g de bicarbonato sódico.
-
5 ml de detergente líquido o
champú.
2-. Elegir la muestra que va a proporcionar el ADN entre
los vegetales que pueda haber en la cocina (cebolla, ajo,
tomates, etc.) y cortarla en cuadraditos.
3.- Triturar la muestra con un poco de agua en la
batidora accionando las cuchillas a impulsos de 10 segundos. Y
así se romperán muchas
células y otras
quedarán expuestas a la
acción del
detergente.
4.- Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado
celular con 10 ml del tampón frío y agitar
vigorosamente durante al menos 2 minutos. Separar después
los restos vegetales más grandes del caldo molecular
haciéndolo pasar por un colador lo más fino
posible. Lo ideal es centrifugar a baja
velocidad 5 minutos y
después pipetear el sobrenadante.
5.- Retirar 5 ml del caldo molecular a un tubo de
ensayo
y añadir con pipeta 10 ml de alcohol isoamílico
enfriado a 0ºC. Se tiene que dejar escurrir lentamente el
alcohol por la cara interna del recipiente, teniendo éste
inclinado. El alcohol va a quedar flotando sobre el
tampón.
6- Se introduce la punta de una varilla estrecha hasta
justo debajo de la separación entre el alcohol y el
tampón. Remover la varilla hacia delante y hacia
atrás y poco a poco se
irán enrollando los
fragmentos de mayor tamaño de ADN. Pasado un minuto
retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el
ADN quedará adherido a su extremo con el aspecto de un
copo de
algodón mojado.
Notas:
-
Si se quiere realizar una extracción
"profesional" puedes agregar enzimas que lo puede hacer
mejor, y el producto que resultaría seria
pura.
-
Cuando añadas el alcohol frío debes
hacerlo de forma que resbale por las paredes del tubo para
que forme una capa sobre el filtrado. Para realizarlo mejor
puedes utilizar la varilla de vidrio o una cucharilla para
ayudarte.
-
Si se expone por mucho tiempo la muestra vegetal a
rayos ultravioletas, esto provoca daños sobre la
estructura del ADN, o aplicar ciertos conservantes que puedan
provocar efectos sobre la cadena del ADN.
El producto filamentoso obtenido de la extracción
no es ADN puro ya que, entremezclado con él, hay
fragmentos de ARN. Una extracción "profesional" se realiza
añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de
ARN e impiden que se unan al ADN.